Засыпкин Сергей Александрович
Спасибо, Елена, за вопрос. Действительно, замысловатое название способно ввести в заблуждение. Откуда оно появилось?
Приставка “кон-“ во многих языках означает сопряжение, соединение связь. У объектива оптического микроскопа существует две плоскости – фокальная, куда помещается рассматриваемый объект и, сопряженная ей, конфокальная, куда объект проецируется. Эта проекция и рассматривается обычно наблюдателем через окуляр. В конфокальном микроскопе самая важная его деталь помещается в эту конфокальную плоскость. Деталь эта – диафрагма с крошечным отверстием. Казалось бы, нелогично. Такая диафрагма отсекает значительную часть света, которую так старательно собирала фронтальная линза объектива, усиливала просветляющее покрытие на каждой линзе качественного объектива, старалась не исказить апохроматическую оптическую схему. Но в этом есть своя логика.
В первую очередь, идея конфокальности возникла для флуоресцентных микроскопов, когда биологи наблюдали меченые флюорохромами объекты в достаточно толстых срезах тканей. Флуорохром возбуждался по всей глубине среза, а высокоапертурный объектив имел очень малую глубинную резкости. В результате маркёры, попавшие в поле зрения объектива, но находящиеся выше или ниже его фокальной плоскости, воспринимались глазом как размытые светящиеся пятна, мешающие наблюдению, или, по-другому, понижающие контраст изображения. Именно для удаления этих помех и помещается в оптическую схему микроскопа конфокальная диафрагма – пинхол. Она пропускает только свет из тонкой фокусной плоскости и отсекает весь остальной. Полученное изображение явно не удовлетворит пользователя, так как несёт слишком мало информации о предмете. Но если таких оптических срезов сделать много со сдвигом по глубине, то, сложив их, мы получим то же самое изображение, что и в обычном флуоресцентном микроскопе, только намного более контрастное и, значит, информативное.
Более того, стопку срезов можно уже интерпретировать как трёхмерное изображение, определяя относительное расположение его элементов в пространстве, и, соответственно, вести точные пространственные измерения.
Конечно, изображения на конфокальном микроскопе невозможно увидеть глазом. Света проникающего через пинхол здесь явно недостаточно. Изображение строится компьютером по данным чувствительного детектора, который в каждый момент времени регистрирует только свет из одной точки, возбуждение или освещение которой осуществляется лучом лазера, последовательно сканирующего всю интересующую исследователя зону препарата. Отсюда ещё одно распространённое название такого микроскопа – лазерный сканирующий.
Выстраивая изображение в системе координат x, y, z, конфокальный микроскоп способен визуализировать на мониторе 3D-объекты (объемные объекты -ред). Высокая скорость сканирования позволяет работать еще с одной координатой – временем, это важно для регистрации физиологических процессов в клетках, а возможность одномоментно фиксировать спектр каждой точки изображения спектральным детектором позволяет ввести в исследования пятую координату – длину волны флуоресценции и одновременно разделять сигналы от 6-10 красителей на одном образце.
Мало того, наличие лазеров в микроскопе натолкнуло на мысль использовать их в качестве манипуляторов над живыми клетками. Например, мощным импульсом лазера можно обесцветить краситель или изменить его цвет в конкретной органелле клетки, и смотреть, с какой скоростью идёт обмен белками между ней и окружающими её структурами. Современное же программное обеспечение позволяет только по одному скану (изображению, полученному поточечным сканированием) дать информацию о взаимных связях между быстро двигающимися объектами (корелляционная микроскопия).
Где конфокальный микроскоп находит применение?
1-Молекулярная биология. Цитология. Изучение структур клеток.
2-Физиология. Изучение процессов, происходящих внутри клеток, механизмы передачи информации в живых структурах.
3-Нанотехнологии. Изучение влияния наноструктур на биологические организмы.
4-Изучение трёхмерных микрообъектов от клещей до кристаллов и микротрубок.
-Точные измерения высот в материаловедении и микроэлектронике.
Это далеко не полный список, который пополняется каждый месяц. Уже сейчас конфокальные микроскопы используются и в медицинских лабораториях для диагностических целей, и в лабораториях, контролирующих технологические циклы в производстве.
