Портал создан при поддержке Федерального агентства по печати и массовым коммуникациям.

НАЙТИ ИГОЛКУ В СТОГЕ СЕНА

Л. ТРУХАЧЁВА, канд. фармацевт. наук.

У благотворительного фонда В. Потанина есть большая, действующая уже несколько лет программа поддержки молодых вузовских педагогов, успешно сочетающих педагогическую и научную работу. Для распределения грантов организован специальный конкурс. Требований к соискателям много, но среди прочего молодые педагоги должны прочитать для студентов старших курсов научно-популярную лекцию по своей специальности. Воплощение этой замечательной идеи, с одной стороны, позволяет понять, знает ли претендент свой предмет, с другой — от таких лекций имеется вполне очевидная польза: студенты расширяют свой кругозор, получая информацию по смежным, а иногда и вовсе далёким специальностям. Фонд дал редакции «Науки и жизни» возможность познакомиться со всеми лекциями, прочитанными грантосоискателями. Некоторые из них мы опубликовали. Нас привлекли в этих лекциях простота и доходчивость изложения (лекция «От улыбки станет всем светлей», «Наука и жизнь» № 3, 2009 г.), важность темы («Уходя, гасите свет!», «Наука и жизнь» № 6, 2009 г.), современное представление о давно известных вещах («Надежда и опора», «Наука и жизнь» № 8, 2009 г.), неожиданный взгляд на, казалось бы, очевидные явления («Биологические сигнальные поля…», «Наука и жизнь» № 1, 2009 г.). Предлагаем вниманию читателей лекцию, прочитанную кандидатом фармацевтических наук Людмилой ТРУХАЧЁВОЙ, доцентом Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова. История поистине детективная…

Ранним августовским утром 1961 года сотни обезумевших птиц атаковали приморский город Капитола в американском штате Калифорния. Безобидные дотоле серые буревестники стаями и поодиночке на большой скорости врезались в окна и стены домов, пикировали на уличные фонари и нападали на прохожих. Этот инцидент вдохновил Альфреда Хичкока на создание фильма «Птицы».

Четверть века спустя, зимой 1987 года, на острове Принца Эдуарда у североатлантического побережья Канады случилась другая загадочная история: более сотни человек стали жертвами сильнейшего пищевого отравления. Оказалось, что все пострадавшие употребляли в пищу голубые мидии. Помимо привычных симптомов — рвоты, спазмов, диареи и головной боли — у больных возникали потеря ориентации, чувство паники, амнезия, а в некоторых случаях приступы судорог и кома. Практически у всех наблюдались симптомы расстройства психики, пациенты проявляли бесконтрольную агрессивность, часто сопровождавшуюся плачем или смехом. К несчастью, трём пострадавшим так и не удалось помочь — они скончались в первые дни. Более чем у четверти других жертв оказалась нарушена кратковременная память. Они не могли вспомнить ничего из того, что произошло после отравления, некоторые не узнавали своих близких.

Позднее выяснилось, что оба случая — и первый с «сумасшедшими птицами», и второй с «отравленными мидиями» — результат воздействия одного и того же токсического агента. Состояние, которое он вызывает, сейчас известно под названием «синдром отравления амнестическим токсином моллюсков» (ASP). Однако ранее не было ни одного сообщения о пищевых отравлениях мидиями с такими неврологическими последствиями.

Для выяснения всех обстоятельств произошедшего, а также для предотвращения подобных случаев Канадский департамент рыболовства поручил группе морских биологов и химиков выделить и идентифицировать токсический агент.

Первоначальное исследование мидий на наличие известных бактериальных и вирусных патогенов не привело ни к чему. Тесты на тяжёлые металлы и пестициды также оказались отрицательными. В состав образцов, взятых для анализа, входили тысячи различных химических соединений. Как можно из такой сложной смеси изолировать один компонент, при этом не зная ничего о его физических или химических свойствах? Задача не легче, чем поиск иголки в стоге сена.

Допустим, что у нас имеется возможность определить, есть иголка в стоге или её там нет. Тогда алгоритм поиска будет следующим. Сначала делим стог на две половины и проверяем, есть ли иголка в одной из частей. Если нет — эту половину отбрасываем, делим пополам оставшуюся и ищем иглу в следующих половинах. Такие манипуляции «раздели—отбрось—раздели» в конечном итоге приведут к тому, что последняя оставшаяся часть будет представлять не что иное, как искомую иголку. По такой же схеме выстраивалась основная стратегия исследователей, перед которыми стояла задача найти и изолировать токсин.

Прежде всего необходимо было разработать тест, достоверно свидетельствующий о токсичности изучаемых объектов. И здесь не обошлось без экспериментов над животными. Было обнаружено, что наиболее характерную реакцию на токсин проявляют мыши. После введения небольших количеств исследуемого образца в случае присутствия в нём токсина у подопытных животных наблюдалась однозначная неврологическая реакция — мыши начинали неконтролируемо царапать и расчёсывать себе плечи задними лапами. Тест жестокий, однако в свете произошедшей трагедии другого выбора у учёных не было.

Для разделения сложных компонентов в отравленных образцах тканей мидий учёные использовали стандартные физико-химические методы. Обработке подвергались как токсичные, так и нетоксичные образцы мидий. Такой подход необходим для последующего сравнительного анализа, ведь любое различие между образцами могло дать ключ к разгадке тайны.

Проследим за всеми шагами процесса, изображённого на схеме, и попробуем понять, что происходило на каждой стадии.

РАЗДЕЛЕНИЕ НА ОСНОВЕ РАСТВОРИМОСТИ И ЛЕТУЧЕСТИ

На первых трёх стадиях согласно общей стратегии исследователи использовали экстракцию и упаривание.

Экстракция — разделение смеси веществ на основе различий в растворимости. О том, что растворимость веществ в разных растворителях различна, хозяйки хорошо знают на примере ванилина, который плохо растворим в воде и хорошо — в спирте. При жидкостной экстракции происходит распределение растворённого вещества между двумя жидкими несмешивающимися фазами. Обычно одна фаза — это вода, а другая — органический растворитель.

При выпаривании происходит концентрирование раствора в результате испарения растворителя. Экстракт можно упарить до небольшого объёма и тем самым добиться повышения концентрации анализируемого компонента.

Теперь, зная, чем полезны экстракция и выпаривание, вернёмся к поискам токсина.

Чтобы предотвратить возможное разрушение искомого соединения в результате нагревания или взаимодействия с растворителем, экстракцию проводили при комнатной температуре водным раствором метанола, среднего по силе растворителя. Экстракция была недостаточной, но тем не менее успешной: мыши проявляли на метанольный экстракт ту же неврологическую реакцию, что и на исходные образцы устриц. Затем экстракт концентрировали упариванием. Отделённый и сконденсированный пар был нетоксичен, а вот полученный остаток давал необходимую реакцию у мышей. Стало ясно, что яд — вещество нелетучее.

Была проведена вторая экстракция. На этот раз концентрированный экстракт встряхивали со смесью полярного и неполярного растворителей. Использовали дихлорметан и воду: эти растворители не смешиваются и образуют два раздельных слоя.

В дихлорметановой фракции обнаружили окрашенные вещества — пигменты фитопланктона (проще говоря — водорослей). И вот это уже могло стать ключом к выяснению природы токсина. Однако сами по себе пигменты не ядовиты, да и дихлорметановая фракция дала отрицательный результат на подопытных мышах. А вот в водном слое токсин присутствовал. Это позволяло полагать, что искомый объект, по-видимому, представляет собой полярное, ионизирующееся вещество. Теперь исследователи могли сконцентрироваться на водной фракции.

На следующих стадиях использовали хроматографические методы анализа. Здесь нам придётся немного углубиться в теорию…

РАЗДЕЛЕНИЕ В ДВИЖЕНИИ

Хроматографический анализ, один из наиболее чувствительных методов, впервые предложенный российским учёным Михаилом Семёновичем Цветом в начале XX века, к началу века XXI превратился в мощнейший инструмент, без которого уже сложно себе представить аналитическую химию, да и не только её.

Первый опыт по разделению и анализу вещества сложного состава, проделанный М. С. Цветом в 1903 году, удивительно прост. Исследователь пропускал через трубку (или, как теперь принято говорить, — колонку) с порошком мела раствор хлорофилла, постепенно разбавляя его бензолом. Через некоторое время в столбике мела стали видны колечки, окрашенные компонентами хлорофилла в разные цвета. Разрезав столбик, М. С. Цвет выделил их в чистом виде и провёл химический анализ каждого отдельного компонента.

Все мы, наверное, так или иначе когда-нибудь занимались хроматографией, особенно повезло в этом смысле нашим родителям. Ведь в прежние годы школьники писали чернилами. И если промокашка попадала на чернильное пятно, то раствор чернил разделялся на ней на несколько «фронтов».

Собственно хроматография основана на распределении одного из нескольких веществ между двумя фазами (например, между твёрдым телом и газом, между двумя жидкостями и т.д.), причём одна из фаз постоянно перемещается. Чем лучше то или иное вещество сорбируется (поглощается) или растворяется в неподвижной фазе, тем меньше скорость его движения, и наоборот, чем меньше сорбируется соединение, тем больше скорость перемещения. В итоге если вначале мы имеем смесь соединений, то постепенно все они, подталкиваемые подвижной фазой, движутся к «финишу» с различными скоростями и в конце концов разделяются.

После разделения необходимо идентифицировать все компоненты и оценить их количественно. Это делается с помощью детекторов, которые уже мало связаны с собственно хроматографическим процессом и основаны на различных физико-химических свойствах изучаемых веществ.

В современных хроматографах длина колонок, в которых происходит разделение веществ, доходит до сотен метров. Для анализа достаточно нескольких миллиграммов (10-3 г) смеси, а обнаружить в ней можно компоненты массой до нескольких пикограммов (10-12 г).

Таковы в общих чертах азы хроматографического анализа. А теперь пора снова вернуться к поискам токсического агента в образцах из мидий.

РАЗДЕЛЕНИЕ НА ОСНОВЕ РАЗЛИЧИЙ В ПОЛЯРНОСТИ

Итак, для разделения смеси в оставшемся водном слое на простые компоненты использовали колоночную хроматографию. Образец пропускали через узкую трубку, содержащую микросферы смолы XAD-2. Эти микросферы удерживают неполярные, незаряженные молекулы и пропускают заряженные ионы. XAD-2 особенно эффективна для разделения органических оснований и кислот.

Ионизированные кислоты проходят через колонку и выходят раньше других органических соединений.

Из множества фракций, прошедших через XAD-2, только одна оказалась токсичной. На заключительной стадии эту фракцию разделили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Здесь вновь полярный раствор, содержащий образец, пропускали через колонку с неполярным сорбентом в качестве неподвижной фазы. Полученная высокоочищенная фракция содержала в себе весь яд отравленных мидий. Так наконец токсин был выделен.

Разделение на основе заряда, размера и формы молекул

Однако исследователи должны были убедиться, что конечная фракция, выделенная методом ВЭЖХ, содержит действительно тот самый токсический компонент. Для этого было решено снова разделить водную фракцию XAD-2, но уже с помощью высоковольтного электрофореза на бумаге.

Электрофорез — это метод разделения ионов на основе различий в их относительных зарядах (отношение величины заряда к массе). Ионы, находящиеся между положительным и отрицательным электродами, под влиянием электрического поля начинают двигаться к электроду с противоположным по знаку зарядом. Обычно, чем больше у иона величина отношения заряда к массе, тем быстрее он двигается к электроду. Маленькие высокозаряженные ионы двигаются впереди больших ионов с низким зарядом. На скорость передвижения влияет и форма молекул. Так, молекулы с более концентрированными зарядами передвигаются быстрее.

Исследователи помещали образец на полоску фильтровальной бумаги. Оба конца полоски погружали в буферные растворы, в каждом из которых находился электрод. В процессе анализа ионы содержащихся в анализируемом образце веществ перемещались с различной скоростью и разделялись в виде отдельных полос на бумаге. Для того чтобы эти полосы «проявились», бумагу опрыскивали специальным реактивом.

При электрофорезе фракции XAD-2 рядом с полосой глутаминовой кислоты (одного из образцов сравнения) была обнаружена неизвестная полоса. В контрольных образцах тканей нетоксичных мидий эта полоса отсутствовала. Кроме того, окраска неизвестной полосы абсолютно отличалась от окраски полосы глутаминовой кислоты. Полосу с неизвестным веществом счистили с бумаги, а полученный образец ввели в колонку ВЭЖХ. Оказалось, что по времени удержания этот образец идентичен основному веществу в конечной фракции, разделённой методом ВЭЖХ. Кроме того, данный образец проявлял такую же токсичность, как и образец, исследованный методом ВЭЖХ.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОКСИНА ПО ЗАРЯДУ И МАССЕ

На заключительном этапе предстояло определить химическую формулу и молекулярную массу выделенного токсина. Задачу решили с помощью масс-спектрометрии.

Этот метод позволяет установить состав молекулы вещества, измерив отношения массы ионов к их заряду. Сначала нейтральные молекулы и атомы превращают в заряженные частицы — ионы, а затем разделяют их, используя законы движения заряженных частиц в магнитном или электрическом поле.

Так вот, с помощью масс-спектрометрии учёные нашли молекулярный вес
(312 г/моль) и молекулярную формулу (С15Н21NO6) выделенного токсина. Спектроскопический анализ выявил присутствие двойных связей и спектров, характерных для аминогруппы. А при сравнении спектров вещества со спектрами в международной базе данных соединение было идентифицировано как домоевая кислота.

Некоторые учёные настаивали на том, что домоевая кислота не может быть ядом, поскольку содержащие её красные водоросли в Японии используют как средство народной медицины от кишечных паразитов. Однако лечебная доза экстракта таких водорослей содержала в общей сложности не более 20 мг домоевой кислоты, в то время как в организме жертв отравления мидиями обнаруживалось до 290 мг. По всей вероятности, безобидное в небольших концентрациях вещество в больших дозах проявляло выраженную токсичность.

Домоевая кислота — своеобразный «троянский конь» в мире молекул. Нервные клетки (нейроны) ошибочно принимают её за молекулы глутаминовой кислоты, и эта ошибка становится для них смертельной. Глутамат (ионизированная форма глутаминовой кислоты) — нейротрансмиттер, молекула, в обязанности которой входит передача нервных импульсов с одной клетки на другую. Когда молекула глутамата связывается с глутаматным рецептором на поверхности клетки, рецептор открывает специальный канал для доступа ионов кальция внутрь клетки. Приток зарядов приводит к возникновению электрического потенциала, который распространяется вдоль клеточной мембраны и передаёт информацию о возбуждении на другие нейроны. Частая стимуляция этого механизма может привести к возникновению новых связей между нейронами, так что глутамат играет ключевую роль в процессах мышления, обучения, запоминания информации.

Но избыточное количество глутамата приводит к неконтролируемому возбуждению клетки и в конечном итоге к её гибели. Причём процесс это каскадный, поскольку перевозбуждение гибнущей клетки передаётся по цепи нейронам, находящимся рядом. В конечном итоге этот биохимический каскад может вызвать повреждение мозга и нейродегенеративные расстройства.

Домоевая кислота похожа на глутаминовую. Однако пятичленное кольцо, содержащееся в её структуре, делает молекулу менее гибкой, чем глутаминовая, что вызывает более жёсткое, плотное связывание домоевой кислоты с глутаминовым рецептором. И в результате её возбуждающий эффект оказывается в 30—100 раз выше.

Но остаётся вопрос — как домоевая кислота могла попасть в ткани мидий, а также в анчоусы, которыми питаются птицы у берегов Калифорнии? Здесь надо вспомнить, что в одной из фракций после экстракции были обнаружены пигменты фитопланктона. Тщательное исследование домоевой кислоты привело к обнаружению её носителей — игловидных диатомовых водорослей, названных Pseudo-nitzschia pungens. Эти водоросли найдены во всех океанах мира и, следовательно, могли стать начальным звеном пищевой цепи во многих регионах. Вот так птицы, в пищу которых попали анчоусы, в свою очередь съевшие ядовитые водоросли, отравились домоевой кислотой.

В настоящее время в большинстве приморских стран проводится постоянный мониторинг морепродуктов с помощью метода ВЭЖХ, чтобы вовремя выявить присутствие домоевой кислоты. Меры оказались успешными, и с 1987 года сообщения об отравлениях не появлялись.

Разгадка этой детективной истории вряд ли оказалась бы возможной без современных физико-химических методов анализа.

Литература

Асатиани В. С. Химия нашего организма. — М.: Наука, 1969, 304 с.

Байбуртский Ф. Хроматография — простой способ анализа сложных веществ // Наука и жизнь, 1998, № 2.


Случайная статья


Другие статьи из рубрики «Лекторий»

Детальное описание иллюстрации

Для экстракции в лаборатории чаще всего используют делительную воронку. Водный раствор пробы и органический растворитель помещают в воронку и тщательно перемешивают встряхиванием вручную или с помощью механического устройства. После разделения фаз нижнюю фазу сливают через кран. Если извлечение нужного компонента неполное, экстракцию повторяют, разделив фазы и прибавив к водной фазе новую порцию органического растворителя.
Через слой неподвижной фазы, покрывающий внутреннюю поверхность капиллярной трубки, течёт подвижная фаза. Компонент А разделяемой смеси обладает большим сродством к подвижной фазе, а компонент Б — к неподвижной фазе. А’ и Б’ — положения зон тех же компонентов через некоторый промежуток времени.
Время от момента ввода пробы в хроматографическую колонку до момента регистрации максимума пика называется временем удерживания (tR). В оптимальных условиях оно не зависит от количества введённой пробы и с учётом геометрических параметров колонки определяется строением того или иного соединения. Количественное содержание компонента характеризуется величиной пика, точнее, его площадью.