Портал функционирует при финансовой поддержке Федерального агентства по печати и массовым коммуникациям.

Нуклеиновые кислоты, жидкие кристаллы и секреты наноконструирования

Доктор химических наук Юрий ЕВДОКИМОВ.

Использование биологических молекул для синтеза искусственных наноструктур на основе принципов, предлагаемых природой, выглядит вполне естественным. В результате самосборки можно получать вещества с уникальными свойствами, в частности, создавать химерные молекулы, содержащие в своем составе, например, аминокислоты и синтетические органические цепи. А это открывает фантастические возможности для конструирования наноматериалов и "переноса" биополимеров из мира биологии в мир техники.

С точки зрения удобства наносборки среди разнообразия биологических соединений выделяются нуклеиновые кислоты. Почему именно они? У нуклеиновых кислот есть несколько характерных особенностей.

Обеспечим библиотеки России научными изданиями!

Короткие (длиной 50-100 нм) двухцепочечные молекулы ДНК и РНК имеют довольно высокую жесткость, а потому их удобно использовать в качестве "строительных блоков". В то же время одноцепочечная нуклеиновая кислота сохраняет гибкость и, кроме того, обладает способностью узнавать комплементарную ей цепочку. Две такие цепочки легко "слипаются" вместе благодаря образованию водородных связей. Если у двухцепочечных молекул есть на концах одноцепочечные "хвостики" (их называют липкими концами), то можно присоединять другие цепочки и формировать места разветвления. А это позволяет создавать плоские решетки и сложные пространственные структуры.

Свойства двумерных и трехмерных структур из нуклеиновых кислот легко регулировать, изменяя среду, в которой происходит сборка (говоря проще, используя разные растворители). В конструкции из ДНК и РНК можно встраивать другие элементы, например биологически активные вещества, которые присоединяются к азотистым основаниям.

Средства современной биотехнологии позволяют производить в промышленных масштабах одноцепочечные и двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот с заранее заданными последовательностями азотистых оснований, поэтому недостатка в "строительных блоках" для наносборки нет.

СТРАТЕГИИ НАНОКОНСТРУИРОВАНИЯ

уществуют две стратегии создания наноконструкций, но, независимо от того, какая из них выбрана, структуру материалов на основе нуклеиновых кислот можно контролировать с молекулярной точностью.

Конструирование "шаг за шагом". Этот подход, основанный на последовательной модификации исходной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или синтетического полинуклеотида, был теоретически обоснован в 1982 году в работе американского химика Неда Зимана.

Первый шаг - получение фрагментов ДНК с липкими одноцепочечными концами. Это можно сделать биохимическими методами или путем прямого химического синтеза. Когда липкие концы разных фрагментов ДНК склеиваются друг с другом, образуется структура с небольшими дефектами - разрывами в сахаро-фосфатных цепях. Разрывы сшивает специальный фермент - лигаза.

Второй шаг состоит в том, чтобы создать точку ветвления, необходимую для формирования крестообразной структуры. Это возможно при использовании фрагментов ДНК со специфической последовательностью азотистых оснований.

Крестообразные структуры совсем не экзотика. Они встречаются в составе молекул ДНК, выделенных из бактерий. У искусственно созданной крестообразной молекулы ДНК можно при помощи ферментов сделать липкие концы. Эти концы обеспечивают соединение с соответствующими комплементарными фрагментами других молекул ДНК. В результате последовательного сшивания липких концов формируется плоская нанорешетка.

Из-за подвижности молекулы ДНК в точке ветвления жесткость получившейся наноструктуры не очень высока. Чтобы ее повысить, разработаны приемы наноконструирования, которые можно назвать "дополнительными" к подходу Н. Зимана. Так, в 1994 году Кристоф Нимейер (Германия) предложил использовать молекулы ДНК, к которым пришиты фрагменты биотина и стрептавидина - белка, связывающего биотин. Этот прием позволяет создавать наноструктуры, имеющие форму замкнутых колец.

В 1997 году американец Дональд Бергстрем использовал для наноконструирования синтетические молекулы, состоящие из двух цепочек нуклеотидов, концы которых сшиты между собой жестким углеводородным мостиком. Из таких деталей можно создавать конструкции в виде звезд с несколькими лучами.

Невысокая жесткость наноструктур типа плоской решетки имеет и привлекательную сторону: такую решетку, при правильном подборе последовательности нуклеотидов, легко сгибать. Нед Зиман в 1991 году получил наноструктуру, имеющую форму куба с ребрами из молекул ДНК. Можно создавать и другие объемные конструкции, например сцепленные октаэдры и додекаэдры.

Технология Зимана красива, но сопряжена с большими экономическими затратами. Для ее применения нужны отрезки нуклеиновых кислот с заданной последовательностью азотистых оснований и целый арсенал ферментов - рестриктаз и лигаз - для расщепления и сшивания фрагментов ДНК в нужных местах. Готовые продукты необходимо аккуратно извлечь из реакционной смеси и провести тщательный анализ их свойств. На всех стадиях такого наноконструирования требуются современные методы контроля, в частности атомная силовая микроскопия.

Практическое применение наноконструкций во многом связано с "гостями" - молекулами или атомами, которые встраиваются в состав исходных цепочек ДНК либо в уже готовую структуру. На этой основе можно сделать биодатчики, которые регистрируют определенные вещества, узнающие молекулы "гостей". Кроме того, если удастся осуществить трехмерное упорядочение единичных наноконструкций (кристаллизацию), то не исключено, что можно будет закристаллизовать внутри них соединения, которые плохо кристаллизуются в обычных условиях. Такой способ перспективен для тонкой очистки "гостей" от посторонних примесей. Однако трехмерное упорядочение само по себе - сложная задача, которая не решена к настоящему времени.

В 1996 году ученые начали применять в качестве "строительных блоков" синтетические одноцепочечные фрагменты нуклеиновых кислот, пришитые к наночастицам коллоидного золота. Из таких "кирпичиков " удается получить структуры, в которых частицы золота расположены на строго фиксированном расстоянии, кратном 3,4 А° - шагу витка двойной спирали. Если пришить к наночастицам золота сразу по несколько фрагментов, то можно создавать трехмерные наноструктуры с регулярным чередованием молекул нуклеиновых кислот и атомов золота.

Внутрь наноструктур можно встраивать не только золото, но и другие металлы, например серебро. Наноэлектроника пока еще не может полагаться на электропроводящие свойства только одной молекулы ДНК, а металлические включения с гарантией обеспечивают электропроводность, необходимую для потенциальных применений в электронных устройствах, например в биодатчиках.

Конструирование по типу "все сразу". Стратегия создания наноконструкций, содержащих двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, разработанная в лаборатории конденсированного состояния нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта, принципиально отличается от всех вариантов конструирования типа "шаг за шагом". Наш подход позволяет получить упорядоченную трехмерную структуру за один прием, и основан он на использовании не единичных молекул нуклеиновых кислот, а их жидкокристаллических дисперсий. Прежде чем приступить к его описанию, скажем несколько слов о жидких кристаллах.

Жидкий кристалл в самом простом случае представляет структуру, состоящую из упорядоченных молекулярных слоев, которые все же сохраняют некоторые диффузионные степени свободы, характерные для поведения молекул в жидком растворе. Можно сравнить жидкие кристаллы с потоком бревен, сплавляемых по реке: в целом все они выстроены в одном направлении, по течению, хотя каждое бревно плывет само по себе.

Существует несколько типов жидких кристаллов. Нас интересуют кристаллы-холестерики, у которых направление ориентации молекул в последовательных слоях меняется по спирали. Происхождение термина "холестерик" связано с тем, что первые изученные жидкие кристаллы с такой закруткой состояли из производных холестерина. Как правило, кристаллы-холестерики получаются из соединений с ярко выраженной анизотропией - неодинаковостью свойств по разным направлениям (например, со спиральной структурой или с оптической активностью). Именно такими свойствами обладают, как известно, ДНК и РНК, от природы закрученные в двойную спираль. Можно сказать, что стремление к спиральной холестерической упаковке - "врожденное" свойство их молекул.

Жидкокристаллические дисперсии образуются, когда довольно жесткие "стерженьки" коротких фрагментов ДНК или РНК выталкиваются из водно-полимерного или водно-солевого раствора и группируются вместе. Этот процесс называется фазовым исключением. Проиллюстрировать его может такой эксперимент: представьте, что вы высыпали в ведро с водой коробок спичек и перемешали, а спички не только всплыли на поверхность, но и слиплись одна с другой в упорядоченную структуру, то есть образовали отдельную "спичечную" фазу.

В результате фазового исключения получаются довольно крупные частицы - жидкокристаллические "капельки" ДНК размером около 0,5 мкм. Их стабильность зависит от свойств раствора. В состав каждой частицы входят примерно десять тысяч молекул, которые располагаются ровными рядами на расстоянии 30-50 А°. Упорядоченность придает частицам свойства кристалла, но при этом соседние молекулы образуют подвижные слои, то есть сохраняют свойства жидкости. А это означает, что получившаяся структура представляет собой жидкий кристалл, причем холестерик, то есть со спиральной закруткой. (Что неудивительно, так как двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот при любом удобном случае проявляют способность к закручиванию в спираль.) Поскольку азотистые основания поглощают ультрафиолет, кристалл-холестерик имеет своеобразную "окраску", которая проявляется в виде аномально высокой оптической активности (способности вращать плоскость поляризации излучения), в десятки и сотни раз превышающей оптическую активность единичных молекул.

Важно то, что при образовании жидкокристаллической дисперсии молекулы нуклеиновых кислот сохраняют способность вступать в химические реакции, то есть образовывать соединения с другими веществами.

Итак, мы имели на руках частицы жидкокристаллической дисперсии, то есть структуру, в которой молекулы нуклеиновых кислот уже упорядочены и малоподвижны, но все же недостаточно стабильны. Оставалось решить фундаментальную задачу - придумать "наномостики", которые сшивают трехмерную конструкцию, а заодно встраивают молекулы "гостей" с нужными нам свойствами.

В качестве материала для строительства наномостиков мы выбрали соединения антрациклино вой группы. Во-первых, антрациклины представляют интерес с медицинской точки зрения, поскольку среди них есть противоопухолевые антибиотики, в частности дауномицин. Во-вторых, они образуют протяженные комплексы с ионами двухвалентных металлов. Но главная особенность антрациклинов, которой мы воспользовались, - способность встраиваться симметричным образом между соседними молекулами нуклеиновых кислот.

Такая стабильная наноконструкция не распадается даже в обычном водно-солевом растворе. Ее можно увидеть с помощью атомно-силового микроскопа. Соседние молекулы нуклеиновых кислот образуют слои, внутри которых и между которыми располагаются полимерные наномостики из чередующихся молекул антибиотика и ионов металла. Мостики придают всей конструкции жесткость, то есть диффузионная подвижность соседних молекул нуклеиновых кислот резко уменьшается.

Нашу наноконструкцию можно назвать холестерик-в-холестерике, поскольку в спираль закручиваются не только стержни из нуклеиновых кислот, но и сами мостики. Холестерик из мостиковых структур "вплетен" в холестерик ДНК, но при этом обладает другими оптическими свойствами, что вызывает особый интерес для будущих исследований.

Созданная нами наноструктура уникальна, поскольку наномостики из молекул антибиотика и ионов меди автоматически решают задачу упорядочения как соседних молекул НК, так и молекул "гостей". Напомним, что в стратегии типа "шаг за шагом" эта задача еще не решена.

НАНОКОНСТРУКЦИИ В ДЕЙСТВИИ

Где можно применять наноконструкции, полученные методом самосборки? Выделим три наиболее перспективных направления.

Доставка лекарств. Наноструктуры могут выступать в качестве носителей генетического материала или введенных в их состав биологически активных соединений. Когда "нанопосылка" попадает в клетку, скрепляющие конструкцию наномостики разрушаются и содержимое, например молекулы антибиотика, высвобождается. Управляемое разрушение наномостиков происходит под действием некоторых белков, таких, как инсулин, пепсин, РНК-аза, g-глобулин, лизоцим, и других соединений. Эта схема обеспечивает локальное терапевтическое действие лекарства, что чрезвычайно важно для практической медицины. Фактически предложенная нами конструкция может стать основой медицинского наноробота, транспортирующего биологически активные соединения в клетки.

Биодатчики. Наноструктуры на основе нуклеиновых кислот могут служить чувствительными элементами оптических сенсорных устройств, реагирующих на присутствие биологически активных соединений . Для этого в наномостик встраивают своеобразную "мину-ловушку" - соединение, которое разрушается при контакте с анализируемым веществом. Наномостик разваливается, нарушается целостность всей наноконструкции, падает аномальная оптическая активность. В определенных условиях по величине этого уменьшения можно измерять концентрацию химического или биологически активного соединения, разрушающего наномостик.

Оптические фильтры. Нам удалось ввести наноструктуры с управляемыми физико-химическими свойствами в состав полимерной пленки без нарушения их аномальных оптических свойств. Это открывает возможность для применения таких полимерных матриц в фотонике в качестве оптических фильтров с регулируемыми оптическими параметрами.

Конечно, предлагаемая нами стратегия наноконструирования с использованием частиц жидкокристаллических дисперсий еще не полностью отработана, поскольку многие вопросы остаются нерешенными. Однако этот подход очень перспективен. Для создания наномостиков можно использовать самые разные химические или биологические соединения или их комплексы; поверхность молекул ДНК и РНК тоже можно модифицировать, регулируя их реакционную способность. Это открывает путь для создания новых типов чувствительных элементов и других наноструктур на основе нуклеиновых кислот, которые найдут применение в различных областях науки и техники.

Иллюстрация "Схемы склеивания фрагментов ДНК".
Липкие концы позволяют "склеить" два фрагмента ДНК. "Склейка" происходит за счет водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований. Места разрыва сахаро-фосфатной цепи сшиваются ферментом лигазой, и образуется полноценная двухцепочечная молекула (А). Таким же образом из фрагментов с липкими концами формируются крестообразные структуры (Б).

Иллюстрация "Куб из ДНК".
Американскому химику Неду Зиману удалось сделать куб из ДНК путем последовательного сшивания фрагментов. Упрощенная схема этого куба показана на рисунке А. Однако построить трехмерную наноструктуру, содержащую в своем составе молекулы "гостей" (Б), методом пошагового синтеза пока не удалось. (Рисунки публикуются с разрешения Н. Зимана.)

Иллюстрация "Структура жидкого кристалла".
Жидкий кристалл в простейшем случае можно представить как структуру, состоящую из чередующихся плоскостей, в каждой из которых соседние молекулы хотя и упорядочены, но сохраняют некоторые диффузионные степени свободы (А). У холестерика ориентация молекул в последовательных слоях меняется по спирали. Величина P/2 - половина шага спиральной структуры холестерика (Б). У молекул полимеров, включая ДНК, кристалл-холестерик можно изобразить в виде наложенных решеток из гибких стержней (В).

Иллюстрация "Холестерический кристалл".
Холестерическую структуру легко обнаружить по оптическим свойствам. Если посмотреть на тонкий слой холестерического кристалла в поляризационный микроскоп, изображение будет разным в зависимости от того, каким образом ориентирована ось холестерика. Если параллельно покровным стеклам (а), то между скрещенными поляроидами наблюдается текстура - периодическое чередование темных и светлых полос (а'), а если перпендикулярно (б), то никакой картины не существует - наблюдается полная темнота (б').

Иллюстрация "Молекулы ДНК в водно-солевом растворе".
Короткие молекулы ДНК в водно-солевом растворе ведут себя как довольно жесткие стерженьки. При определенных условиях они выталкиваются из раствора и собираются вместе, образуя частицы жидкокристаллической дисперсии. При этом появляется аномальная оптическая активность, которая регистрируется в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма, расположенной в ультрафиолетовой области - там, где поглощают азотистые основания. Если структура молекулы нарушается, то и оптическая активность снижается. На этой основе можно сделать датчик, реагирующий на очень тонкие изменения в свойствах молекул нуклеиновых кислот.

Иллюстрация "Антрациклины".
Похожие на удлиненные капли частицы жидкокристаллической дисперсии ДНК, сшитые внутри наномостиками, достаточно стабильны. Их можно осадить на ядерном мембранном фильтре. Средний размер частиц - около 500 нм. Темные точки - отверстия в фильтре. Изображения получены при помощи атомного силового микроскопа (г. Зеленоград).


Случайная статья


Другие статьи из рубрики «Биология»