Портал создан при поддержке Федерального агентства по печати и массовым коммуникациям.

НОБЕЛЕВСКИЕ ПРЕМИИ 2007 ГОДА. ГЕНЫ ПОД ПРИЦЕЛОМ

Кандидат химических наук О. БЕЛОКОНЕВА.

В этом году нобелевская премия по физиологии и медицине присуждена за технологию, которая произвела революцию в экспериментальной медицине. С ее помощью ученые могут создать модель любого заболевания не в пробирке, а непосредственно в организме животных. В числе нобелевских лауреатов — выдающийся ученый современности профессор из Лондона сэр Мартин Эванс и американские исследователи Марио Капекки и Оливер Смитис. Они научились делать то, что еще четверть века назад казалось фантастикой, а сегодня стало рутинным методом биологических исследований — создавать животных с заданными генетическими изменениями.

Если дословно, Нобелевская премия присуждена за “открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток”. Этот метод в современном виде разработан не так давно — в конце восьмидесятых годов прошлого века — и широко используется в исследованиях для определения функции того или иного неизвестного гена.

Все началось со стволовых клеток — предшественников всех клеток организма, о существовании которых ученым было известно уже сто лет назад. Но лишь в начале 80-х годов прошлого века будущему нобелевскому лауреату Мартину Эвансу (см. “Наука и жизнь” № 10, 2001 г. и № 11, 2007 г.) удалось идентифицировать, выделить и вырастить в лаборатории стволовые клетки мышиного эмбриона. Это событие само по себе уже было огромным достижением. Оно положило начало нового, на сегодняшний день самого развивающегося раздела клеточной биологии, изучающей превращения стволовых клеток в другие клетки организма. Но Эванс не остановился на достигнутом. В статье, опубликованной в 1981 году в июльском номере журнала “Nature”, он предсказал, что полученная им культура стволовых клеток станет инструментом для создания животных с заданными генетическими изменениями. Его собственные работы подтвердили правильность высказанного предположения.

Эванс и его сотрудники внедрили генетический материал эмбриональных стволовых клеток в половые клетки мыши. В 1984 году в очередной публикации в журнале “Nature” они сообщили о введении эмбриональных стволовых клеток мыши-донора в стволовые клетки другого мышиного эмбриона. Затем эмбрион, состоящий из стволовых клеток двух различных мышей, имплантировали в организм суррогатной мамы-мыши. В результате на свет появилось химерное потомство, несущее генетические признаки двух разных животных. Отбирая потомков химер, несущих признак мышей-доноров, Эвансу удалось получить чистую линию грызунов, генетически идентичных мышам-донорам. Это было начало.

На следующем этапе исследователям предстояло показать, что с помощью стволовых клеток можно получать генетически модифицированное (трансгенное) потомство. В качестве модели Эванс выбрал наследственное заболевание, которым страдают только мужчины, — синдром Леш-Нихана. У больных этим синдромом в Х-хромосоме “не работает” ген, кодирующий фермент с трудным названием “гипоксантин фосфорибозилтрансфераза” (HPRT).

В геном стволовых клеток ввели ген ретровируса (вируса, гены которого встраиваются в хромосомы клеток хозяина). С помощью ретровируса ученым удалось внедрить “ген болезни Леш-Нихана” в геном культуры эмбриональных стволовых клеток мыши-донора, а затем ввести генетически модифицированные донорские стволовые клетки в эмбриональные клетки другой мыши. Химерный эмбрион имплантировали самке мыши, и на свет появилось потомство, “мужская” половина которого была носителем “гена болезни”. Потомство дало приплод, примерно четвертая часть которого (в соответствии с менделевским расщеплением) наследовала болезнь Леш-Нихана. Так появился метод получения трансгенных животных, при котором новый признак наследуется потомством. Кроме того, впервые удалось создать “мышиную” модель человеческого заболевания.

В экспериментах Эванс получил трансгенных животных, чей геном содержал новый или мутантный ген с известными функциями. А как быть, если цель исследования — изучить функционирование совершенно неизвестного гена? И в очередной раз Эванс оказался провидцем. Он предсказал, что с помощью разработанного им метода ученые смогут не только создавать модели уже известных генетических аномалий, но и определять функции совершенно неизученных генов. Так и произошло. На смену технологии получения трансгенных организмов с новым или модифицированным геном пришла технология получения животных с “выбитым” геном (нокаут-мышей).

Для разработки нового метода ученым пригодилось открытое в 1958 году нобелевским лауреатом Джошуа Ледербергом явление гомологической рекомбинации. Суть его в следующем. В каждой клетке имеются хромосомы, унаследованные как от отца, так и от матери. Хромосомы обмениваются парными участками, увеличивая генетические различия в популяции. В начале 1980-х годов профессор университета Юты (США) Марио Капекки предположил, что не только свои собственные хромосомы, но и чужеродная, введенная извне, ДНК также может обмениваться парными участками с ДНК хозяина.

Предположение казалось слишком смелым. Комиссия Национального института здоровья США, куда ученый подал заявку на получение гранта, отказала Капекки в финансировании проекта, сочтя его амбициозным. Эксперты заключили, что весьма маловероятно, чтобы чужеродная ДНК была способна внедриться в хромосому клетки-хозяина. Тогда же по той же причине Медицинский исследовательский совет Великобритании отклонил аналогичную заявку Мартина Эванса...

Но Капекки не сдался. Он продолжал исследования в этом направлении. В 1985 году ему удалось создать клеточную линию с генетическим дефектом, делающим ее нечувствительной к действию антибиотика неомицина. Затем он устранил этот дефект, введя в мутантные клетки “нормальную” ДНК. Ген удалось “починить” в одной из тысячи клеток — это была довольно высокая частота обмена участками хромосом, вселившая в исследователя надежду на применение этой технологии для направленной модификации генов в клетках млекопитающих.

В дальнейшем Марио Капекки и исследователь из университета Северной Каролины Оливер Смитис изобрели способ “выбивания” (нокаутирования) генов. Метод заключается в том, что в клетку вводятся синтетические фрагменты последовательности ДНК “выбиваемого” гена, похожие на природный ген, но слегка химически модифицированные. Фрагменты вводятся методом электропорации — через поры в клеточной мембране, созданные при помощи электрического поля. В результате синтетический участок “испорченной” ДНК внедряется в хромосому на место “нормальной” ДНК. Новый “испорченный” ген в клетке уже “не работает”.

Поскольку в результате этих манипуляций “портилась” лишь одна клетка из тысячи, Капекки разработал стратегию обогащения клеточной культуры клетками с “выбитым” геном. Он добавил в синтетическую ДНК не только фрагмент, похожий на “выбиваемый” ген, но и другую генетическую последовательность, делающую клетки устойчивыми к действию какого-либо антибиотика. Благодаря этому клетки с “выбитым” геном становились устойчивыми к действию этого антибиотика и их можно было легко отделить от обычных клеток. Так Капекки и Смитис независимо друг от друга научились “выбивать” ген в культурах клеток, но получать многоклеточные организмы с неработающим геном они пока не умели.

Все было готово для создания линий мышей с “выбитыми” генами: продемонстрировано, что мутации в геноме стволовых клеток можно ввести в организм мышей и эти мутации будут наследоваться потомством, разработан метод перенесения и “выключения” гена в стволовой клетке и, наконец, выработана стратегия обогащения клеточной культуры клетками с “выбитым” геном. Настала пора переходить от опытов в пробирке к экспериментам с живыми системами. Капекки и Смитис пригласили Эванса к сотрудничеству. С его помощью американские исследователи получили культуру эмбриональных стволовых клеток мышей одной линии с “выбитым” геном, эти клетки были введены в стволовые клетки мышей другой линии, и из потомства химерных

животных выведена чистая линия мышей с “выбитым” геном. Лабораторных грызунов с “выбитым” геном так и назвали — нокаут-мыши.

Новую технологию назвали генетическим таргетингом (от английского target — мишень). В качестве молекулярной мишени выступает определенный ген. Для изучения функций того или иного гена ученые прицельно “выбивают” его из генома. Метод позволяет исследовать роль каждого конкретного гена в развитии организма и его нормальном и патологическом функционировании и изучать различные человеческие болезни, используя нокаут-мышей в качестве модельных объектов.

До наступления “эры таргетинга” моделью исследования ученых была клеточная культура. Но, как остроумно заметил физиолог Хеймо Эмке, “у клеток не бывает давления”. Поскольку многие гены человека и мыши похожи по структуре и функциям, в руках ученых появился инструмент, с помощью которого стало возможным экспериментально проверить функции того или иного гена в организме человека. Определенной болезни поставлен в соответствие определенный ген. Родилась новая наука — генетическая физиология.

Первая статья, в которой таргетинг был использован для получения породы нокаут-мышей, вышла в 1989 году. С тех пор наука ушла далеко вперед. Уже выведены линии мышей с более чем десятью тысячами “выбитых” генов. Это половина всего мышиного генома. Теперь, после завершения расшифровки генома мыши и человека, исследователи всего мира занимаются последовательным нокаутированием генов мышиного генома и выяснением функции каждого из них. Таргетинг генов помог понять роль многих сотен генов в эмбриональном развитии млекопитающих, развитии органов и формировании плана построения организма в целом. Работы Капекки пролили свет на причины различных врожденных уродств плода у человека.

Исследования осложняются тем, что далеко не все болезни вызваны дисфункцией одного гена. В большинстве случаев к проявлению симптомов болезни приводит нарушение “работы” многих генов. Несмотря на сложности, Смитис с коллегами из университета Северной Каролины вывели породу генетически модифицированных мышей, страдающих заболеванием, сходным с человеческим атеросклерозом, а также мышей, у которых проявления атеросклероза возникали на фоне пищи, богатой холестерином. Исследование регуляции этих генов привело к появлению новых лекарственных препаратов. Не менее эффективной новая технология оказалась в изучении раковых заболеваний.

Можно сказать, что современная экспериментальная медицина изучает большинство заболеваний человека и разрабатывает новые лекарства посредством технологии таргетинга. В руках исследователей — мощнейшее оружие борьбы с наследственными заболеваниями, и конкретных результатов осталось ждать совсем недолго.

“Наука и жизнь” о стволовых клетках и трансгенных животных:

Белоконева О. Технологии XXI века в России: быть или не быть? — 2001, № 1, с. 3.

Белоконева О. Праматерь всех клеток. — 2001, № 10, с. 18.

Захаров И. Рожать нельзя клонировать. — 2002, № 9, с. 34.

Свидиненко Ю., Чубенко А. Будущее медицины: биотех или нанотех? — 2005, № 2, с. 7.

Гриневич В. Гормоны головного мозга. — 2005, № 4, с. 11.

Зимина Т. Биотехнология на службе безопасности. — 2005, № 6, с. 18.

Белоконева О. “Чудо-клетка”. — 2007, № 11, с. 86.

Обеспечим библиотеки России научными изданиями!


Случайная статья


Другие статьи из рубрики «Наука. Вести с переднего края»

Детальное описание иллюстрации

Марио Капекки, род. в 1937 году в Италии, гражданин США, профессор генетики и биологии человека университета Юта, Солт-Лейк-Сити, США. Разработал метод нокаутирования (“выбивания”) гена в культуре стволовых клеток и стратегию обогащения культуры стволовых эмбриональных клеток нокаутными клетками. Фото с сайта www.la-croix.com.
Сэр Мартин Эванс, род. в 1941 году в Великобритании. Директор Школы биологических наук, профессор генетики млекопитающих университета Кардифф, Великобритания. Впервые получил культуру эмбриональных стволовых клеток, разработал метод введения наследуемых мутаций в геном млекопитающих (получения трансгенных животных). Фото с сайта www.news.bbc.co.uk.
Оливер Смитис, род. в 1925 году в Великобритании, гражданин США. Профессор патологической и лабораторной медицины университета Северной Каролины на Чэпел Хилл, США. Усовершенствовал методику “выбивания” гена в культуре стволовых клеток. Создал экспериментальные модели сердечно-сосудистых заболеваний. Фото с сайта www.unc.edu.
А. Стволовые клетки выделяют из эмбриона донорской мыши (в данном случае — мышь розового цвета) на ранней стадии развития и культивируют в лаборатории. В культуру клеток внедряют поврежденный синтетический фрагмент ДНК и ген устойчивости к антибиотику. “Испорченный” ген встраивается в одну клетку из тысячи. Для обогащения культуры мутантными клетками проводится специальная селекция по чувствительности к антибиотику. В результате получают чистую популяцию нокаутных стволовых клеток с “выбитым” геном.
Б. Генетически модифицированные нокаутные стволовые клетки вводятся в зародыш другой мыши (в данном случае — мышь желтого цвета), который имплантируется в организм суррогатной мамы — самки мыши. Рождается химерное потомство, несущее как “испорченные”, так и нормальные гены. При скрещивании химерных мышей с обычными на свет появляется потомство, у четвертой части которого “выбит” один из генов. Таких животных называют нокаут-мышами (розового цвета). Для облегчения идентификации трансгенных животных донорские эмбриональные стволовые клетки и эмб-рион взяты у мышей, окрашенных в разные цвета: донорские клетки — у розовой, зародыш — у желтой. Иллюстрации с сайта www.nobelprize.org.
У нокаут-мыши (внизу) “выбит” ген, отвечающий за один из путей обмена веществ в печени. После инъекции парализующего агента обычная мышь (вверху) через 2 часа приходит в себя, поскольку токсичное вещество распадается в печени и выводится из организма. Нокаут-мышь через 2 часа после получения дозы парализующего вещества продолжает оставаться неподвижной. Фото с сайта: www.bcm.edu.